奧林巴斯倒置CKX53顯微鏡結(jié)合網(wǎng)格計(jì)數(shù)板是觀察和計(jì)數(shù)細(xì)菌的常用組合，其操作簡(jiǎn)便、成像清晰，適用于微生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)及工業(yè)發(fā)酵等領(lǐng)域的細(xì)菌定量分析。以下從設(shè)備準(zhǔn)備、樣本處理、觀察計(jì)數(shù)及注意事項(xiàng)四個(gè)方面進(jìn)行系統(tǒng)性說(shuō)明：

一、設(shè)備與材料準(zhǔn)備

顯微鏡配置

奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡：

光源：優(yōu)先選用LED光源（如CKX-LED），提供穩(wěn)定均勻的照明，減少熱量對(duì)細(xì)菌活性的影響。

物鏡：根據(jù)細(xì)菌大小選擇10×、20×或40×物鏡（NA≥0.25），確保視野清晰且覆蓋網(wǎng)格區(qū)域。

目鏡：10×目鏡（視野直徑約1.8-2.0mm）適合常規(guī)計(jì)數(shù)，若需更高精度可換用15×或20×目鏡。

網(wǎng)格計(jì)數(shù)板：

類(lèi)型：常用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（如Neubauer改進(jìn)型）或?qū)Ｓ眉?xì)菌計(jì)數(shù)板（如Petroff-Hausser計(jì)數(shù)室）。

規(guī)格：

Neubauer計(jì)數(shù)板：中央?yún)^(qū)域分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格含16個(gè)小方格（邊長(zhǎng)0.2mm，面積0.04mm2），深度0.1mm（體積0.004mm3=0.000004mL）。

細(xì)菌專(zhuān)用計(jì)數(shù)板：網(wǎng)格更細(xì)（如0.02mm2/小方格），適合高密度樣本。

輔助工具

蓋玻片（厚度0.17mm）、載玻片（可選）、移液器（10μL量程）、無(wú)菌吸頭、酒精棉球、記號(hào)筆。

二、樣本處理與制片

樣本稀釋

目的：將細(xì)菌濃度調(diào)整至20-200個(gè)/中方格（Neubauer計(jì)數(shù)板）或50-150個(gè)/小方格（細(xì)菌專(zhuān)用板），避免過(guò)度密集或稀疏。

方法：

初步估算濃度：取10μL樣本與990μL無(wú)菌水混合（1:100稀釋?zhuān)?，重?fù)稀釋至合適范圍。

制片步驟

清潔計(jì)數(shù)板：用酒精棉球擦拭計(jì)數(shù)板和蓋玻片，晾干后避免指紋污染。

蓋玻片放置：將蓋玻片輕壓在計(jì)數(shù)室上，確保無(wú)氣泡且邊緣密封（防止樣本溢出）。

加樣：用移液器吸取10μL稀釋后的樣本，從計(jì)數(shù)室邊緣緩慢注入，利用毛細(xì)作用使樣本均勻填充計(jì)數(shù)室。

靜置：等待2-3分鐘使細(xì)菌沉降，避免移動(dòng)計(jì)數(shù)板導(dǎo)致分布不均。

三、顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)

顯微鏡設(shè)置

對(duì)焦：切換至相差模式（若CKX53配備相差附件）或明場(chǎng)模式，調(diào)節(jié)粗/細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使網(wǎng)格線清晰可見(jiàn)。

光源調(diào)整：降低光源強(qiáng)度至適中（避免熒光干擾或細(xì)菌光損傷），關(guān)閉聚光鏡虹彩光圈以減少眩光。

視野選擇：優(yōu)先計(jì)數(shù)中央?yún)^(qū)域（如Neubauer計(jì)數(shù)板的4個(gè)角及中央共5個(gè)中方格），減少邊緣效應(yīng)。

計(jì)數(shù)規(guī)則

邊界處理：對(duì)壓線細(xì)菌采用“數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右"原則（或統(tǒng)一計(jì)數(shù)上邊和左邊的細(xì)菌）。

死菌區(qū)分：若需區(qū)分活菌與死菌，可提前用臺(tái)盼藍(lán)染色（活菌拒染，死菌染藍(lán)），或通過(guò)形態(tài)差異（如破碎細(xì)胞）判斷。

重復(fù)計(jì)數(shù)：對(duì)同一樣本重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次，取平均值以提高準(zhǔn)確性。

四、注意事項(xiàng)與優(yōu)化技巧

避免誤差來(lái)源

樣本均勻性：稀釋后充分混勻，避免細(xì)菌沉降導(dǎo)致濃度不均。

網(wǎng)格對(duì)齊：確保計(jì)數(shù)板網(wǎng)格與顯微鏡視野十字線平行，減少計(jì)數(shù)偏差。

時(shí)間控制：計(jì)數(shù)應(yīng)在樣本制備后30分鐘內(nèi)完成，防止細(xì)菌繁殖或死亡影響結(jié)果。

特殊場(chǎng)景處理

高密度樣本：進(jìn)一步稀釋至可計(jì)數(shù)范圍，或改用熒光染色結(jié)合自動(dòng)計(jì)數(shù)軟件（如ImageJ的Cell Counter插件）。

運(yùn)動(dòng)性細(xì)菌：在樣本中加入少量甲醛（終濃度0.5%）固定細(xì)菌，或使用瓊脂覆蓋法限制運(yùn)動(dòng)。

鏈狀/簇狀細(xì)菌：記錄鏈或簇的數(shù)量，按單個(gè)細(xì)菌計(jì)算（或根據(jù)研究需求調(diào)整規(guī)則）。

設(shè)備維護(hù)

清潔：使用后用壓縮空氣吹除計(jì)數(shù)板殘留樣本，避免腐蝕金屬部件。

校準(zhǔn)：定期檢查顯微鏡光源強(qiáng)度、物鏡分辨率及網(wǎng)格計(jì)數(shù)板精度（如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)微球驗(yàn)證）。

五、應(yīng)用案例

發(fā)酵工業(yè)：監(jiān)測(cè)乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的活菌數(shù)變化，優(yōu)化發(fā)酵條件（如pH、溫度）。

環(huán)境監(jiān)測(cè)：計(jì)數(shù)水體中的大腸桿菌群落，評(píng)估水質(zhì)污染程度。

臨床診斷：快速檢測(cè)尿液或血液中的病原菌濃度，指導(dǎo)抗生素用藥劑量。

通過(guò)規(guī)范操作和細(xì)節(jié)優(yōu)化，奧林巴斯CKX53顯微鏡結(jié)合網(wǎng)格計(jì)數(shù)板可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌濃度的快速、準(zhǔn)確測(cè)定，為微生物研究提供可靠數(shù)據(jù)支持。