使用奧林巴斯正置熒光顯微鏡 CX33 觀察植物細(xì)胞時(shí)，需結(jié)合植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（如細(xì)胞壁、葉綠體等）和熒光標(biāo)記需求，從樣品制備到顯微鏡操作進(jìn)行系統(tǒng)性規(guī)劃。以下是詳細(xì)步驟及注意事項(xiàng)：

一、樣品制備與熒光標(biāo)記

1. 植物材料選擇與預(yù)處理

材料類型：

幼嫩葉片（如擬南芥、煙草）、根尖、花粉管等薄而透明的組織，可直接撕取表皮或制作徒手切片；

較厚的組織（如莖稈、成熟葉片）需用切片機(jī)切成 50-100 μm 的薄片，或通過壓片法（如根尖染色體觀察）分散細(xì)胞。

預(yù)處理（可選）：

固定：若觀察動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)（如微管、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)），可用 4% 多聚甲醛固定 15-30 分鐘，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞；

通透：需標(biāo)記胞內(nèi)蛋白時(shí)，用 0.1% Triton X-100 處理 5-10 分鐘，增強(qiáng)染料進(jìn)入細(xì)胞的效率。

2. 熒光染色與標(biāo)記

根據(jù)觀察目標(biāo)選擇染料：

觀察對象常用熒光染料 / 標(biāo)記方法激發(fā) / 發(fā)射波長（參考）操作要點(diǎn)

細(xì)胞核 / DNADAPI（藍(lán)色熒光）、Hoechst激發(fā) 358nm / 發(fā)射 461nm染色 5-10 分鐘，需避光；可與 RNA 酶預(yù)處理減少非特異性結(jié)合。

細(xì)胞壁Calcofluor White（白色熒光）激發(fā) 350nm / 發(fā)射 440nm直接滴加染液染色 2-5 分鐘，適用于纖維素和幾丁質(zhì)檢測。

葉綠體自發(fā)熒光（紅色）激發(fā) 430-480nm / 發(fā)射 650-700nm無需染色，直接觀察；避免強(qiáng)光長時(shí)間照射導(dǎo)致熒光淬滅。

特定蛋白GFP/GFP 融合蛋白（綠色熒光）激發(fā) 488nm / 發(fā)射 507nm通過轉(zhuǎn)基因或病毒載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，需培養(yǎng) 24-48 小時(shí)后觀察。

線粒體Mito-Tracker Red（紅色熒光）激發(fā) 579nm / 發(fā)射 599nm工作濃度 100nM，37℃染色 15-20 分鐘，需避光。

制片注意事項(xiàng)：

將染色后的樣品置于載玻片中央，滴加少量蒸餾水或 PBS 緩沖液（避免細(xì)胞脫水），蓋上蓋玻片時(shí)從一側(cè)緩慢放下，避免氣泡產(chǎn)生；

若樣品易移動(dòng)，可在蓋玻片四周用凡士林或指甲油封片，增強(qiáng)穩(wěn)定性。

二、顯微鏡操作流程

1. 基礎(chǔ)光路調(diào)節(jié)

放置與開機(jī)：將顯微鏡放置于穩(wěn)定臺(tái)面，遠(yuǎn)離光源直射和振動(dòng)源，開啟電源，預(yù)熱光源（汞燈或 LED 光源需預(yù)熱 5-10 分鐘至亮度穩(wěn)定）。

低倍鏡找樣：

安裝 10× 低倍物鏡，將樣品裝片置于載物臺(tái)，用壓片夾固定，使樣品正對通光孔；

調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋下降鏡筒（目視側(cè)面避免物鏡壓片），再緩慢上升鏡筒，直至視野中出現(xiàn)清晰的細(xì)胞輪廓（可通過調(diào)節(jié)聚光器高度和孔徑光闌改善對比度，植物細(xì)胞因有細(xì)胞壁，可適當(dāng)縮小光闌增強(qiáng)結(jié)構(gòu)反差）。

2. 熒光觀察參數(shù)設(shè)置

選擇濾光片組：

根據(jù)熒光染料波長選擇對應(yīng)濾光片，例如：

DAPI/Calcofluor White：使用 UV（激發(fā) 330-385nm，發(fā)射 420nm 以上）濾光片組；

GFP：使用 BP470/40（激發(fā) 470nm）+ DM495（分束鏡）+ BP525/50（發(fā)射 525nm）濾光片組；

葉綠體自發(fā)熒光 / Red 熒光染料：使用 BP545/30（激發(fā) 545nm）+ DM575 + BP605/70 濾光片組。

調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度：

初始觀察時(shí)將光源強(qiáng)度調(diào)至 50%，避免強(qiáng)光損傷樣品或產(chǎn)生背景噪聲；

通過調(diào)節(jié)熒光光路中的光闌或中性密度濾鏡（ND 濾鏡）控制光強(qiáng)，兼顧信號(hào)亮度和抗淬滅性。

3. 高倍鏡精細(xì)觀察與對焦

切換物鏡：在低倍鏡下將目標(biāo)細(xì)胞移至視野中央，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器至 40× 或 60× 高倍物鏡（若觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可使用 100× 油鏡，需在蓋玻片上滴加一滴香柏油，使物鏡與樣品光學(xué)接觸）；

微調(diào)焦與景深控制：

使用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋緩慢調(diào)節(jié)焦距，植物細(xì)胞因有大液泡，可能需要分層對焦（如聚焦于細(xì)胞核、葉綠體層）；

若細(xì)胞厚度較大導(dǎo)致熒光信號(hào)重疊，可通過顯微鏡配套的 Z 軸掃描功能（如有）進(jìn)行多層拍攝，后期用軟件疊加或三維重建。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 樣品與染色優(yōu)化

自發(fā)熒光干擾：植物細(xì)胞中的葉綠素（紅色熒光）、木質(zhì)素（藍(lán)色熒光）可能對觀察產(chǎn)生背景干擾，可通過以下方式減少：

選擇不含葉綠體的組織（如根尖、莖尖分生區(qū)）；

使用窄帶濾光片或調(diào)節(jié)激發(fā)光波長，避開自發(fā)熒光峰值；

拍攝時(shí)降低熒光通道的增益或曝光時(shí)間。

染色特異性：

熒光染料需現(xiàn)配現(xiàn)用，DAPI、Calcofluor White 等需避光保存；

染色后用緩沖液充分洗滌，去除未結(jié)合的染料，減少背景熒光。

2. 顯微鏡操作技巧

避免光損傷：熒光觀察時(shí)避免長時(shí)間照射樣品（尤其是 GFP 等易淬滅的標(biāo)記），可通過 “快速預(yù)覽 - 定位 - 短時(shí)間拍攝" 的方式操作；

色差校正：高倍鏡觀察時(shí)，若出現(xiàn)彩色邊緣，可通過調(diào)節(jié)物鏡上的色差補(bǔ)償環(huán)（若有）或使用復(fù)消色差物鏡改善。

3. LV2000顯微鏡相機(jī)圖像采集與分析

參數(shù)設(shè)置：成像軟件中調(diào)整曝光時(shí)間（通常 50-500ms，根據(jù)熒光強(qiáng)度）、增益（避免過高導(dǎo)致噪點(diǎn)），勾選 “線性響應(yīng)" 模式保證信號(hào)真實(shí)性；

多通道拍攝：若同時(shí)觀察多種熒光（如 DAPI+GFP），需采用順序掃描模式（避免通道串色），并保存為多通道 TIFF 格式以便后期分析。

四、常見問題與解決方案

問題可能原因解決方案

熒光信號(hào)弱染色濃度不足、激發(fā)光強(qiáng)度低增加染料濃度、延長染色時(shí)間；調(diào)大光源強(qiáng)度或更換新燈泡（汞燈壽命約 200 小時(shí)）

背景熒光強(qiáng)染料未洗凈、自發(fā)熒光干擾增加洗滌次數(shù)；選擇無自發(fā)熒光的組織或使用淬滅劑（如 DABCO）

圖像模糊對焦不準(zhǔn)、樣品移動(dòng)重新微調(diào)焦；用指甲油封片固定樣品；檢查載物臺(tái)是否穩(wěn)固

葉綠體自發(fā)熒光干擾激發(fā)光波長與葉綠素重疊更換長波激發(fā)濾光片（如觀察 GFP 時(shí)用 488nm 激發(fā)，避開葉綠素 430nm 激發(fā)峰值）

通過以上步驟，可高效利用奧林巴斯 CX33 正置熒光顯微鏡觀察植物細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白定位或生理過程，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)對植物細(xì)胞動(dòng)態(tài)行為的精準(zhǔn)分析。